中枢脱髓鞘新型标志物：PLP1-IgG

蛋白脂质蛋白（PLP1），是由PLP1基因编码的一种高度疏水、拥有四段跨膜结构域的蛋白，DM20与PLP1为同一基因编码，由基因可变剪接产生，二者胞外结构域一致，胞内结构仅相差35个氨基酸（图2B）。在中枢神经系统中，成年大脑PLP1的表达显著高于DM20，其在脑白质中含量最高，占中枢神经系统髓鞘总蛋白的50%以上，其主要功能包括促进髓鞘致密化、调控少突胶质细胞成熟、保护轴突等。外周神经系统的施万细胞同样表达PLP1和DM20，但是DM20通常为优势亚型，PLP1/DM20对外周神经正常功能不可或缺，完全缺失这两种蛋白的患者会发生脱髓鞘型周围神经病变。

Trotter 等人（1987）向实验动物注射佐剂联合PLP1蛋白，即可诱导发病产生实验性变应性脑脊髓炎（EAE），说明这种蛋白极有可能是多发性硬化自身免疫损伤的主要攻击靶点。

Warren等人（1994）在1.8%（5/284）的活动期MS患者中检测出PLP1抗体阳性，该类阳性患者无传统免疫异常标志物（寡克隆区带、鞘内 IgG 合成升高少见），常规脑脊液生化、细胞计数基本正常，极易漏诊。

Owens等人（2023）首次使用患者原生脑脊液单克隆抗体直接证明 PLP1 复合物是 MS 体液免疫致病靶标。

研究设计：研究从多发性硬化（MS，含复发型、临床孤立综合征 CIS）患者脑脊液中分离克隆扩增的浆母细胞，构建人源重组抗 PLP1 单克隆 IgG 抗体（rAb）；同时制备无关对照抗体用于阴性对照；随后在体外组织切片、体外细胞、体内实验动物中探索其致病性及抗原特性，以及通过临床患者数据探索脑脊液抗 PLP1 抗体能否作为 MS 高特异性诊断标志物。

体内动物实验核心致病证据：实验动物采用 PLP-EGFP 荧光标记小鼠（少突胶质细胞带绿色荧光），丘脑脑内注射「抗 PLP1 重组抗体 + 人补体」混合液：

1.72 小时后注射区域 EGFP 阳性少突胶质细胞大面积丢失；

2.病灶大量 CD68⁺巨噬 / 小胶质细胞浸润、髓鞘表面沉积终末补体复合物；

3.巨噬细胞吞噬少突胶质细胞胞体与髓鞘，完整复刻 MS 急性期病灶全部组织病理特征；

4.而仅注射抗体、不加补体：几乎无少突胶质损伤，证实补体是损伤必需条件；

5.在 PLP1 全敲除小鼠体内注射相同抗体 + 补体：完全不形成病灶、无少突胶质死亡，直接证明 PLP1 是该抗体产生病理损伤的唯一必需靶抗原。

抗原识别特性：仅识别髓鞘天然构象 PLP1 蛋白。

1.小脑器官切片、活少突胶质细胞实验均证明抗原表位位于髓鞘外膜；

2.抗体不识别变性、线性PLP多肽；甲醇、丙酮等固定剂破坏蛋白三维结构后，抗体完全无法结合，说明致病表位为构象依赖性；

3.PLP1 蛋白关键结构决定致病结合能力：胞外二硫环、N 端棕榈酰化半胱氨酸发生点突变后，抗体完全失去结合能力，无法再诱导细胞损伤。

临床患者证据：该类致病抗体在 MS 患者鞘内特异性产生。

1.大样本脑脊液检测：80 例临床确诊 MS 患者中 57.5% 可检出抗 PLP1抗体；所有炎症/非炎症对照（视神经脊髓炎 NMO、脑炎、脑肿瘤、头痛等）全部阴性，特异性极高；

2.鞘内合成证据：配对脑脊液/血清 IgG 对比，脑脊液抗体结合强度是外周血 8.2 倍以上，证明抗体由中枢B细胞原位生成，而非外周血液渗透进入中枢；

3.病程全覆盖：复发缓解型、继发进展型、原发进展型 MS、初次发病视神经炎阶段患者均可检出，抗体可长期持续存在（随访 18 个月仍阳性），提示参与疾病全程病理损伤。

图1.PLP1-IgG在多发性硬化中临床意义探索的图形摘要

既往研究多在多发性硬化患者体内检出PLP1-IgG，但受抗原检测体系差异（是否保留天然构象）影响，各研究阳性检出率差距显著，同时多数现有研究纳入的其他中枢神经系统自身免疫性脱髓鞘疾病（ADD）病例数量有限。最近，Masciocch等人建立活细胞法（L-CBA），该技术可完整保留PLP1天然膜构象、检测准确度更高，基于此方法系统开展研究，全面阐释抗 PLP1 抗体在各类中枢脱髓鞘自身免疫病中的临床应用价值。

1.构建可表达全长 PLP1 蛋白的活细胞检测体系（L-CBA）（宿主细胞为人胚肾 293T 细胞）

2.采用针对 PLP1 胞外环状结构域不同表位的单克隆抗体及患者血清进行验证，证实该活细胞表面可表达上述胞外表位（图2B）

3.共定位实验验证抗体的抗原结合特异性（图2C）

4.免疫吸附试验验证抗体抗原结合特异性（图 2D）。

图2.PLP1作为靶抗原的鉴定与验证

A. 采用PLP1不同表位（PLP1⁵⁰⁻⁶⁹、PLP1¹⁷⁸⁻¹⁹¹、PLP1²⁰⁰⁻²¹⁹）的单克隆抗体及患者PLP1-IgG阳性血清证实构建的活细胞表面靶抗原表达。

B. PLP1结构示意图：彩色氨基酸序列标示了单克隆抗体识别的不同表位（黄色=PLP150-69；绿色=PLP1178-191；蓝色=PLP1200-219）及其胞内区域（红色标识区域在DM20蛋白亚型中缺失）。

C. 共定位实验：PLP1-IgG阳性患者血清（绿色）与PLP1单克隆抗体（红色）与大鼠脑部有髓神经区域（小脑、纹状体和海马体）共结合；比例尺：50 μm。

D. 细胞免疫吸附实验：PLP1-IgG阳性患者的血清经MOG转染细胞预吸附后染色结果未改变（中间列）；而经PLP1转染细胞预吸附后，CBA和TBA的结合均消失（右列）。

1.构象依赖性：PLP1-IgG与靶抗原结合依赖其天然构象，固定会导致结合能力下降甚至消失。

2.与DM20交叉反应：1）研究者提出假说：合并外周神经受累的PLP1-IgG阳性患者血清，可与DM20发生交叉反应；2）随后研究者采用表达DM20蛋白的活细胞CBA方法检测进行验证，在36例可获得标本的 PLP1-IgG 阳性患者中29例DM20-IgG阳性；所有合并外周受累的ADD患者中，100%（12/12）可检出PLP1-IgG和DM20-IgG双阳性；而仅中枢病变的患者中，该交叉反应阳性率为70.8%（17/24），同时PLP1-IgG阳性患者中无神经束蛋白、接触蛋白等相关的郎飞氏结抗体，排除其他周围神经疾病干扰。这些结果综合解释了该抗体为何易引发CNS+PNS联合病变。

3.IgG亚型：68.3%为IgG1/IgG3亚型（无IgG4）。

4.抗体具有补体依赖细胞毒性：体外实验证实，PLP1-IgG可激活补体，造成表达PLP1的细胞死亡，直接证明该抗体具备致病性。

研究先后设置回顾性探索队列（自身免疫性脱髓鞘疾病（ADD，284例）+对照组（177例））与前瞻性验证队列（ADD，824例）。

疾病组分类标准：

1.将患者分为MS、AQP4-IgG NMOSD、MOGAD，MS进一步划分为典型多发性硬化与非典型多发性硬化。

满足以下任意一项表现，即可判定为非典型多发性硬化：（1）长节段横贯性脊髓炎（LETM）；（2）双侧视神经炎（ON）；（3）视交叉受累；（4）瘤样脱髓鞘病

2.无法归入上述类别的脱髓鞘疾病患者，统一划分为其他脱髓鞘疾病，并再细分为单纯视神经炎、横贯性脊髓炎（TM）、血清阴性视神经脊髓炎谱系疾病（SN-NMOSD）、中枢合并周围神经系统受累的脱髓鞘疾病（CNS+PNS ADD）。

对照组：非炎症性神经系统疾病（NINDs，包括阿尔茨海默病（AD）和正常压力脑积水（NPH））、其他炎症性神经系统疾病（OINDs）以及健康人（HCs）。

1.对照组：177例均为阴性，证明该抗体对ADD具有高特异性。

2.ADD患者总阳性率：1104例患者中共检出42例阳性。

3.各亚组阳性率(两大队列结果高度一致):

4.阳性患者构成：其他ADD（19例）＞MS(12例)＞MOGAD（11例）；4例阳性患者符合血清阴性NMOSD的诊断标准（图3）。

图3.PLP1-IgG在不同队列及不同诊断亚组中的分布

研究对象包括来自(A)回顾性探索队列和(B)前瞻性验证队列的患者。(C)显示探索队列与验证队列各诊断亚组中PLP1-IgG阳性患者的占比。*在缺乏足够临床信息的824例患者中，有73例被排除在图表之外，这些患者MOG/AQP4/PLP1-IgG检测结果均为阴性

人口学与前驱症状

· 中位年龄51岁（8~77岁），43%为女性，4名儿童患者均为MOGAD；

· 43%患者存在前驱事件（感染、新冠疫苗接种等），其他ADD组前驱事件发生率显著更高。

核心临床表现

其他ADD组（19例，最大阳性亚组）

1.主要症状：脊髓炎、脑脊髓炎、视神经炎、68.4%合并周围神经系统受累（最典型特征）。

2.影像特征：

·  影像最典型表现：脑脊髓多发脱髓鞘病灶（占 78.9%，15/19）。

·  脑部病灶：幕上多发病灶多见，脑室周围、灰质易受累；脑干病灶常靠近脑神经入脑区；超半数视神经病变累及视交叉；多数脑部病灶钆强化，好发于室管膜周边、软脑膜。

·  脊髓病灶：以多发病灶为主，常累及脊髓圆锥伴神经根强化；部分为长节段横贯性脊髓炎。

3.预后：急性期残疾程度重，中位残疾评分EDSS=5(1.5-9)，47.3% EDSS≥6.0分，随访中位时间16个月（4~54个月）后，无人完全康复，31.6%仍重度残疾，26.3%出现复发。

MOGAD组（11例）

PLP1-IgG阳性者与阴性组的区别：

·  年龄更大（中位37岁vs 13岁，p=0.007）；

·  外周神经受累概率显著升高（36.4% vs 3%，p=0.01）；

·  残疾评分EDSS显著高于阴性组（中位5 分vs 3分，P=0.04），病情更重。

MS组（12例）

PLP1-IgG阳性组与阴性组差异

·  58.3%表现为非典型MS特征，比例显著更高（58.5% vs 6%，p＜0.001）；

·  发病初期EDSS评分更高（中位3分 vs 2分，p=0.01）；随访阶段也是显著更高（中位4.7分 vs 1.5分，p＜0.001），整体病程更凶险（图4）。

图4.PLP1-IgG阳性自身免疫性脱髓鞘疾病患者的诊断分组与临床特征

A. PLP1-IgG阳性ADD患者分为三组：其他ADD组，MOGAD组，MS组；B 疾病进程期间 EDSS 量表评估的残疾程度；C. PLP1-IgG阳性 MOGAD 或MS患者与相应PLP1-IgG阴性组疾病进程中的EDSS平分比较。

ADD = 自身免疫性脱髓鞘疾病；b = 双侧；BsE = 脑干脑炎；CerS = 小脑综合征；CNS+ PNS ADD = 伴有外周及中枢神经系统受累的ADD； EDSS = 扩展残疾状态量表；FU = 随访；EMyR = 脑脊髓神经根炎； LETM = 纵向广泛型横贯性脊髓炎；My = 脊髓炎；MyR = 脊髓神经根炎；MSSS = MS严重程度评分；ON = 视神经炎； TDL = 肿胀性脱髓鞘病变。

临床提示

精准诊断：对于血清阴性NMOSD、不明原因脑脊髓炎、非典型MS、中枢合并周围神经脱髓鞘患者，建议加做PLP1-IgG检测，对疾病进行精准诊断。

提示预后：病情重是PLP1-IgG阳性患者的共同特征，PLP1-IgG非典型MS（长节段脊髓炎、瘤样病灶等）及MOGAD患者MSSS及EDSS评分显著比阴性患者的高，一旦查出阳性，可强化治疗，延缓疾病进展。