大势所趋，单分子检测来了

当今全球范围内，免疫诊断进入了以大型全自动化学发光为主流，多种检测技术原理、检测平台形式多样化发展的局面。

化学发光技术凭借其绝对领先的灵敏度、准确性与精密度，无疑是当前免疫诊断技术中最可靠的检测方法，它贯穿了从全自动大型设备，到小型全自动POCT设备甚至到微流控POCT的全线免疫诊断产品。

然而，化学发光技术从上世纪70年代中期诞生，到近十年随着自动化技术的迅速发展，替代了酶联免疫成为免疫诊断市场最核心的技术，已经经历了超过40年的时间。

而在这40年里，无论是酶促化学发光、直接化学发光或是电化学发光，化学发光的检测技术却并没有任何检测原理层面上的改变，现有的化学发光检测在灵敏度、准确度的提升几乎是完全依赖于自动化设备精密度的提升以及发光分子衍生物结构上的改造。

在设备自动化技术已经发展到相当高水平的今天，现有的化学发光技术检测灵敏度已经接近于其理论上的检测极限水平。

对于现有的免疫检测体系而言，若需要以更高灵敏度的检测方法去探寻新的生物标志物，或是开发新型免疫诊断市场方向，势必需要在检测原理层面上进行技术本质的革新。

一种新型的超灵敏检测手段, 在生物分子的定量检测领域开始了广阔的应用前景，这种新手段名为单分子检测技术(Single Molecule Detection，简称SMD)， 指在单分子水平上通过生物分子的构象变化、动力学、分子之间相互作用以及对单个分子进行操纵等方式进行检测。

与整体分析法相比，单分子检测（SMD）方法能提供观测物的分布和时间轨道，能够对异质群体中的单个分子进行观察、鉴定和分类，能提供直接的生物大分子的结构和功能之间关系的信息。

目前, 单分子检测技术可以分为三类: 一类是荧光成像(包括离体和在体成像)及光谱学, 一类是基于力学的操作和检测(包括光阱、磁阱、原子力显微镜及纳米孔等)，另一类是电化学检测法。

1. 单分子荧光检测技术

原理：

在激光照射下，荧光分子从基态到激发态，发射光子回到基态。根据荧光寿命和分子在激光束中停留时间，可算出单个分子发射的最大光子数为10⁵-10⁶。目前光学检测系统收集、检测光子的效率为1%或0.5%-5%，故单个分子仍可被检测到数千光子信号。检出限约为0，应用最广。

单分子荧光检测由于具有信噪比高、灵敏度高和样品消耗少等特征，可对单个分子、微粒、细胞及病毒等进行检测和成像, 可用于研究在溶液中极难观察到的小概率事件、动力学慢事件和异常分布；以及可实时监测生化反应过程研究分子结构与功能之间的关系等显著优势，因而成为单分子检测技术中发展最为迅速的一种。

2. SMD技术的关键点

实现单分子免疫检测是分析化学检测的一个终极目标，但是由于单分子检测对象的浓度极低，因此在实际操作中会出现很多的干扰因素，影响检测结果。如何提高检测的效率，尽可能的降低检测带来的误差，也成为这一领域的研究目标。专家认为：“单分子检测能力的高低与其说是检测灵敏度的提高，不如说是背景噪音的降低”。其技术关键点如下所示：

1）杂散光/噪声背景的消除

单分子检测的过程中，我们常常需要克服一个关键难点：杂散光背景比荧光信号大很多。因此为了更好的实现单个分子的检测，必须最大化的降低杂散光的干扰。杂散光的主要来源：瑞利散射光、光学器件散射光、样品的自发荧光、检测器暗电流、溶液的拉曼散射。杂散光/噪声对检测的影响极为严重。

为了降低噪声，要选择低噪声、高效的光学材料元件和检测器，对溶液进行过滤，对溶液、载体进行预漂白；此外，还可以通过选择合适的激发与发射波长以降低背景噪声。

2）提高光子检测效率

检测器是单分子荧光探测的关键部分，由于单个分子的荧光很弱，这就要求荧光检测器具有较高的量子效率和很低的暗计数。目前常用的超敏检测器是ICCD和APD，最终希望光子检测效率达到0.1％以上。

目前，提高光子检测效率可采取的主要措施有：①提高光子收集效率，减少传输过程中的损失。在整个光子传输的过程中，现在主要运用的是光纤导线传输，有效的提高收集量；②使用单光子检测器。

3）提高信号强度

提高信号强度可以选择的策略有：①选择体积大的荧光探针载体（如纳米微球），加大焚光探针数量；②选择多重标记的荧光探针载体，也就是在一个分子上同时标记多个荧光分子；③挑选荧光强度高的荧光探针；④可以通过纳米材料（如纳米金、纳米银、量子点等）的辅佐，增加荧光强度。

3. SMD发展趋势

呈现以下趋势：

（1）发展不易光解、性能稳定的荧光标记物和新型标记方法, 提高单分子生物传感器的性能;

（2）改进单分子检测仪器, 使其操作更加简单方便、价格更加低廉;

（3）将单分子检测与适配体、等温扩增等技术相结合, 提高检测特异性和灵敏度;

（4）研发能同时检测多种物质的单分子技术, 研究由多组分构成的复杂分子马达;

（5）改进单分子检测方法, 在接近生理条件、活细胞甚至是生物整体水平中实现单分子实时检测。

单分子检测技术以超灵敏水平测量生物标志物，使研究人员能够仔细检查关键的生物标志物。目前，这项技术已经被应用于多个治疗领域，包括肿瘤学、神经学、心脏病学、炎症和传染病。

在阿尔茨海默疾病方面，单分子检测技术能够更早发现疾病、更好预测未来，以改善生活质量和寿命。