自身免疫性脑炎系列|抗CRMP2抗体
自身免疫性脑炎（AE）是一类由免疫反应介导的炎症性疾病，与AE有关的抗神经抗体检测对该病具有确诊意义。目前已知多种AE相关抗体，但仍有许多AE病例因未知抗体而无法解释。今天我们将介绍自身免疫性脑炎系列之抗CRMP2抗体，该抗体在2022年首次在自身免疫性小脑炎的患者中被鉴定出来。
CRMP2概述及定位
塌陷反应介质蛋白（CRMPs）家族是细胞质中的微管结合蛋白，在大脑皮层、海马、小脑、未成熟和成熟的少突胶质细胞神经元中高度表达。CRMP2是CRMPs家族中的一员，主要在神经元细胞质和轴突中表达，在许多生理过程中发挥着关键作用，例如神经元极化和迁移、轴突导向、轴突运输、突触形成、突触信号传导以及神经递质释放。CRMP2与多种中枢神经系统疾病的发生、进展密切相关，如阿尔茨海默病、缺氧缺血性脑病、精神分裂症和抑郁症、急性期脊髓损伤、自身免疫性视网膜病变、自闭症等。
抗CRMP2抗体在脑炎中的发现及验证
抗CRMP2抗体于2022年由徐等人首次在Frontiers in Immunology杂志上报道与自身免疫性小脑炎相关。
一名38岁女性患者（P1），其临床表现为急性发作、发热、反复恶心呕吐、持续性头晕以及小脑共济失调体征，包括视物旋转、言语不清，行走不稳。脑脊液检查显示白细胞轻度升高，葡萄糖和蛋白水平正常。颅脑计算机断层扫描（CT）、磁共振成像（MRI）和磁共振血管造影（MRA）结果均正常。
由于临床怀疑与自身免疫性脑炎有关，因此对患者的血清和脑脊液样本进行全面的抗体筛查，包括抗NMDAR、LGI1、Caspr2、GABABR、AMPAR、DPPX、DNER、D2R、mGluR5、GAD65、IgLON5、Hu、Yo、Ri、Ma2、PCA2、两性蛋白（amphiphysin）以及CRMP5抗体，结果全为阴性。然而，P1患者的脑脊液（图1A）和血清（图1B）进行TBA检测时提示抗体阳性反应，在大鼠脑切片的大脑皮层，海马及小脑浦肯野细胞显示荧光染色。同时P1患者的血清在培养的皮层神经元的细胞质中也显示出免疫荧光染色（图1C）。基于此，推测该患者可能是由未知的抗体引起的自身免疫性脑炎。
图1.患者脑脊液和血清抗体检测
图1A和1B分别是患者脑脊液和血清的TBA检测
图1C是患者血清在培养的神经元细胞中进行免疫染色反应
研究人员随后对该未知抗体进行鉴定。先通过大鼠脑蛋白裂解物进行免疫沉淀结合蛋白质免疫印迹技术（Western blot）分析，在70kDa发现一条条带（图2），对该可见条带进行质谱分析发现CRMP2为可能的靶抗原，而该抗体在脑炎患者中属于首次发现。
图2.患者体内抗神经抗体靶抗原的鉴定
接下来，研究人员对刚才的发现进行了验证。首先通过商业抗CRMP2抗体和P1患者的血清对过表达CRMP2的HEK293T细胞（图3A）和培养的神经元（图3B）进行免疫染色，发现两者能够很好的共定位。其次当P1患者的血清预先与过表达CRMP2的HEK293T细胞进行免疫吸附排除抗CRMP2抗体后，再进行TBA检测，在鼠脑切片上未检测到免疫反应信号（图1B）。这些数据表明，除了CRMP2抗体外，P1患者的血清中不存在其他针对神经元的抗体。
图3.患者血清抗CRMP2抗体的验证
此外，为了阐明抗CRMP2抗体患者的临床特征，研究人员还对46例其他神经系统疾病患者的血清样本进行了抗CRMP2抗体的回顾性筛查，这些样本在大鼠脑切片上显示神经细胞的细胞质免疫染色阳性，其中包括15例自身免疫性疾病、6例脑血管疾病、5例感染性脑炎、8例原因不明的脑炎、1例间变性星形细胞瘤和11例其他神经系统疾病。其中1例患有脑脊髓炎的42岁女性患者P2，该患者的血清在与CRMP2过表达细胞共染色时呈现阳性反应（图3A）。此外，当P2患者完全康复并在1.5年后重新评估时，其血清中的阳性染色消失(图3A)。
由于CRMP2属于高度保守的CRMP家族，研究人员进一步确定了患者抗体的特异性。通过构建CRMP1-5的表达质粒，证实P1和P2患者的血清仅与CRMP2反应（图4），该抗体具有很高的特异性。
图4.抗CRMP2抗体特异性验证
抗CRMP2抗体阳性患者对免疫治疗的反应
两名抗体阳性患者对免疫治疗均有良好的反应。
P1经过免疫治疗（IVIG和甲泼尼龙）后，症状有所改善，3个月后改良Rankin量表（mRS）评分为2分。
P2经过免疫治疗和抗结核治疗后，症状显著改善，3个月后mRS评分为0分。
抗CRMP2抗体致病性探索
上述研究表明抗CRMP2抗体是AE的一个新抗体，但作为细胞内抗原，该抗体是否具有致病性？带着这个疑问，同一研究团队对抗CRMP2抗体对主动免疫小鼠模型的致病潜力进行了探索。
研究方法：
使用7-8周龄的雌性C57BL6/J小鼠，通过皮下注射重组CRMP2蛋白建立主动免疫小鼠模型，随后对主动免疫小鼠进行行为、组织病理学及电生理等一系列检查
研究结果：
# 抗体检查：免疫小鼠在第4周和第8周的血清中检测到高滴度的抗CRMP2抗体（超过1:16000）。免疫小鼠的血清与商业抗CRMP2抗体免疫荧光可以共定位，在蛋白免疫印迹实验中结果相同。
# 行为变化：CRMP2免疫小鼠表现出运动协调能力受损和焦虑样行为，但未表现出认知或社交行为的显著变化。
# 组织病理学：未观察到CRMP2免疫小鼠脑组织的明显组织病理学变化或免疫细胞浸润。
# CRMP2磷酸化水平：CRMP2免疫小鼠脑组织中CRMP2的磷酸化水平未受影响。
# 神经元兴奋性：CRMP2免疫小鼠的海马锥体神经元兴奋性显著增加，这可能是抗CRMP2抗体导致行为变化的潜在机制。
综上，抗CRMP2抗体在小鼠体内可能通过增加神经元兴奋性来引发行为变化，而无需引起明显的组织病理学变化。
抗CRMP2抗体作为一个新发现的与AE相关的抗体，具有潜在的致病性，应纳入AE抗体检测中去，但未来还需要更多病例来阐述其具体的临床特征。