副肿瘤小脑变性相关抗体TRIM9/67
副肿瘤小脑变性（ paraneoplastic cerebellar degeneration，PCD）是一种罕见的神经系统综合征，以肿瘤相关的亚急性小脑共济失调为特征。PCD的诊断主要依赖于在患者血清、脑脊液中检测到特定的自身抗体。临床实践中，不断有新的PCD抗体被发现，本次小编将介绍PCD相关的新型抗体TRIM9/67。
三结构域蛋白（tripartite motif，TRIM）家族成员超70种，是一类具有E3泛素连接酶活性的蛋白质。该蛋白家族的一个显著特点是不同结构域之间的排列顺序高度保守，大多数TRIM蛋白从N端到C端的顺序依次是RING锌指结构域，一个或两个B-box结构和一个卷曲螺旋结构域（coiled-coil，CC），又被称为RBCC结构域。RBCC结构域后通常有一到两个高度可变的C端结构域，决定了每个TRIM蛋白的特异性。基于C端结构域的差异，TRIM蛋白家族分为11 个亚类(CⅠ-CⅪ)，其中TRIM9/67属于CⅠ亚类（图1），定位于细胞内。TRIM9/67均是最先在哺乳动物大脑皮层的神经元中被发现，而在后续研究中发现其在多种肿瘤中也高表达，其在天然免疫、神经发育、细胞骨架动态和多种疾病中发挥重要作用。
图1.TRIM9/67结构示意图
抗TRIM9/67抗体于2019年在PCD患者中被首次报道。
发现实验：Le Duy Do等研究人员在2007年10月至2016年6月期间，对超过8000份疑似自身免疫性脑炎或副肿瘤神经综合征患者的脑脊液样本进行了检测。通过免疫组化技术，筛选出32份未明确神经靶标抗体且疑似PCD患者的样本，并进一步对这些样本进行分析。
患者1的脑脊液显示出与小脑、海马和大脑皮层的神经细胞细胞质和神经毡的特殊反应性（图2A）。免疫组化显示，海马CA3神经元的细胞体和近端树突的细胞质中存在弥散性免疫反应性，小脑的分子层神经细胞、浦肯野细胞的细胞体和树突有明显的免疫标记（图2B）。免疫印迹实验显示，患者1的脑脊液识别出2条分子量约72 kDa和95 kDa的特异性蛋白条带（图2C），通过质谱分析确认TRIM9和TRIM67特异性富集在 95 kDa 条带中，72 kDa 条带也含有 TRIM9，但不含TRIM67。
图2.抗TRIM9/67抗体发现实验：患者1脑脊液免疫组化及免疫印迹分析
m:分子层，g:颗粒层，pk:浦肯野细胞层
确证实验：
通过转染表达TRIM9和TRIM67的HEK293细胞，证实了患者脑脊液中的抗体能够识别这两种蛋白（图3A）。此外，使用TRIM9和TRIM67基因敲除（KO）小鼠的大脑切片进行免疫染色，结果显示患者脑脊液中的抗体仅针对TRIM9和TRIM67（图3B）。
图3：抗TRIM9/67抗体确证实验
（图A.HEK293转染细胞免疫染色；图B.基因敲除小鼠大脑切片免疫染色）
使用HEK293转染细胞筛选其他31例疑似 PCD 患者，发现第二例患者。在2名患者的血清和脑脊液中均发现了针对TRIM9和TRIM67的高滴度抗体。患者 1 的抗 TRIM9 抗体滴度（血清：1/128 000，脑脊液：1/8000 ）高于患者 2（血清：1/64000 ，脑脊液：1/4000），而两名患者的抗 TRIM67 抗体滴度相同（血清：1/256000，脑脊液： 1/8000）。
患者1：78岁女性，表现为亚急性小脑共济失调，初始脑部MRI检查正常，脑脊液检查提示有炎症反应（蛋白质：0.65 g/l；淋巴细胞 17/mm3；超过 10 个寡克隆带（OCB）；IgG 指数为 1.52（正常 <0.7）），PET影像检查提示为低分化肺腺癌。经化疗（卡铂和紫杉醇）、皮质类固醇和免疫球蛋白治疗后，神经系统症状无改变，发病两年后仍健在。
患者2：65岁男性，IB期肺腺癌患者，只进行手术切除治疗，2年后发展为亚急性小脑共济失调，脑部MRI提示正常，脑脊液检查显示有炎症反应（蛋白质：0.41 g/l；淋巴细胞 9/mm3，淋巴浆细胞活化；OCB 少；IgG 指数 0.65（正常 <0.7）），PET影像检查提示肿瘤转移，患者拒绝进一步检查以及免疫调节治疗，在纵隔放疗后 10 年内失访。12 年后，患者仍健在，患有稳定但严重的小脑共济失调，其癌症没有复发。
抗TRIM9/67抗体的特异性评估：
为了评估抗TRIM9/67抗体的特异性，研究者还检测了来自不同患者群体的血清和脑脊液样本作为对照，包括小细胞肺癌患者、肺腺癌患者、自身免疫性脑炎患者以及无炎症性神经退行性疾病患者。结果显示所有对照组样本均未检测到这两个抗体。
既往文献报道3例患有副肿瘤性神经系统综合征的患者中具有针对 TRIM46（TRIM 家族另一CⅠ亚类成员）的抗体，研究人员进一步测试2名患者脑脊液是否也识别TRIM46；结果均为阴性（图4）。
综上，抗TRIM9/67抗体在这两名PCD患者中具有特异性。
图4.2名PCD患者脑脊液对3种靶抗原识别情况
IgG亚型分析显示患者脑脊液中的抗体主要为IgG1亚型（图5）。
图5.IgG亚型分析
通过编码TRIM9和TRIM67不同结构域的DNA构建物进行表位作图，发现抗体能够识别TRIM9/67蛋白上的多个表位（图6）。
图6.抗 TRIM9/67抗体的表位定位
TRIM9 和 TRIM67 都与发育中的神经元细胞形态发生有关。本研究进一步探讨了患者脑脊液中的抗体对神经元存活和发育的影响。实验发现，这些抗体并未对体外培养的小鼠皮层神经元的存活或生长产生显著影响。
一项多中心、回顾性研究，研究人员评估多种抗TRIM9/67抗体检测方法，包括基于组织的免疫荧光（TBIF）、噬菌体展示免疫沉淀测序（PhIP-Seq）、基于细胞的检测（CBA）和免疫印迹（Western blot），其中CBA是检测抗TRIM9/67抗体最敏感的方法（100%敏感性），所有病例均检测到TRIM9和TRIM67自身抗体（图7）。
图7.检测病例、样本类型及结果分类热图
研究定义至少通过两种检测方法确认为抗TRIM9/67抗体阳性的病例是阳性病例，该研究共纳入了13个抗体阳性的病例，在10例有临床病史的病例中，最常见的表现为亚急性小脑综合征（7/10），其次是脑炎（3/10）。
所有小脑综合征病例在 3-4 周内发展为泛小脑综合征。在病例 1 中出现了小脑情感综合征，在病例 3 中，出现执行功能障碍和顺行性遗忘症。7例小脑综合征患者中有6例患者癌症：肺腺癌（3例）、小细胞肺癌（1例）、黑色素瘤（1例）和乳腺癌（1例）。其中4例是在癌症诊断后出现小脑综合征的。剩下的2例患者中，恶性肿瘤是在副肿瘤综合征的检查过程中发现的。所有6例癌症患者在出现神经系统症状时都已存在转移性疾病。
急性期脑脊液检测显示，所有小脑综合征病例均出现轻度至中度的淋巴细胞增多（8–74个细胞/µL，参考值≤5个细胞/µL），而总蛋白水平正常或轻度升高（3例升高，58–98 mg/dL，参考值≤50 mg/dL）。4例有可用结果的病例中IgG指数均升高，其中3例还存在脑脊液特异性的寡克隆带。在6例接受至少一种免疫调节剂治疗的病例中，只有1例的神经系统症状有所改善。
3例脑炎患者，2例（病例7和8）表现为亚急性边缘性脑炎（LE），1例表现为亚急性可能的自身免疫性脑炎（病例9）。有2例（病例7和8）出现轻度淋巴细胞增多（分别为16个和6个细胞/µL），IgG指数升高（分别为1.9和1.1），且脑脊液中存在超过5条寡克隆带（OCBs；病例9未进行OCBs检测）。尽管最初已知抗神经自身抗体检测结果为阴性，但病例7在发病一年后出现了血清乙酰胆碱受体抗体和重症肌无力（胸部CT未检测到胸腺瘤）。病例8的血清中存在高滴度的GAD65抗体（1389 nmol/L，参考值≤0.02），脑脊液中也存在（36.4 nmol/L，参考值≤0.02）。
病例7在接受左乙拉西坦、大剂量口服泼尼松和多轮血浆置换治疗后，注意力、意识和认知功能有显著改善，但在接下来的一年里，他的精神状态出现了亚急性下降，癫痫再次复发，多次影像学检查仍未发现肿瘤。尽管接受了多种免疫治疗，他的病情仍在恶化，最终在发病约3.5年后去世。病例8最初对抗癫痫药物有反应，但在康复期间其GAD65抗体持续存在（血清中为1983 nmol/L），尽管使用了糖皮质激素和利妥昔单抗，其癫痫发作仍难以控制。病例9患有小细胞肺癌，在接受化疗和免疫抑制治疗后，记忆障碍几乎完全缓解。
抗TRIM9/67抗体阳性的病例中，亚急性小脑综合征是最常见的表现形式，且多数患者伴有癌症。抗TRIM9/67抗体作为新型特异性生物标志物，应当将其加入到PCD抗体谱中以辅助临床诊断。基于现有的小样本量的检测方法对比，CBA敏感度最高，可作为首选检测方法。
参考文献
[1] 马小梅,舒星富,陈遥,赵钰,张博文,马忠仁,张海霞.TRIM9在疾病中的作用研究进展[J].中国细胞生物学学报,2023,45(3):526-532.
[2] 陈艳清, 曹树辉, 李传友. 三结构域蛋白(TRIM)家族结构及功能的研究进展 [J] . 中华微生物学和免疫学杂志, 2017, 37(6) : 479-484.
[3] Do LD, Gupton SL, et al. TRIM9 and TRIM67 Are New Targets in Paraneoplastic Cerebellar Degeneration. Cerebellum. 2019 Apr;18(2):245-254.
[4] Bartley CM, Ngo TT, Do LD, et al. Detection of High-Risk Paraneoplastic Antibodies against TRIM9 and TRIM67 Proteins. Ann Neurol. 2023 Dec;94(6): 1086-1101.